Producción y caracterización de la fenol oxidasa de Scytalidium thermophilum / Yasmin Sánchez Rosario

Tesis Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural El Colegio de la Frontera Sur 2010

Bibliografía: hoja 48-56

Índice de Figuras.. Índice de Tablas.. Resumen.. 1. Introducción.. 2. Marco Teórico.. 2.1 Compuestos fenólicos.. 2.1.1 Clasificación.. 2.2 Fenol oxidasas.. 2.2.1 Tirosinasas.. 2.2.2 Lacasas.. 2.2.3 Sitio y modo de acción.. 2.3 Hongos Termófilos.. 2.3.1 Scytalidium thermophilum.. 2.3.1.1 Descripción de S. thermophilum.. 3. Objetivos.. 3.1 Objetivo General.. 3.2 Objetivos Específicos.. 4 Materiales y Métodos.. 4.1 Material biológico.. 4.2 Medios de conservación y cultivo.. 4.3 Preparación del inóculo.. 4.4 Cinética de crecimiento.. 4.4.1 Obtención del extracto.. 4.5 Métodos Analíticos.. 4.5.1 pH.. 4.5.2 Biomasa.. 4.5.3 Azúcares.. 4.5.4 Proteínas solubles.. 4.5.5 Actividad enzimática.. Efecto de pH y temperatura sobre la producción de fenol oxidasa.. 4.7 Purificación de la fenol oxidasa de S. thermophilum.. 4.7.1 Obtención del extracto proteico.. 4.7.2 Columna cromatográfica de intercambio iónico.. 4.8 Caracterización de fenol oxidasa de S. thermophilum.. 4.8.1 Efecto de pH y temperatura.. 4.8.2 Determinación de parámetros cinéticos (kcat y KM de la fenol oxidasa.. 4.8.3 Determinación de actividad catalasa.. 4.8.4 Determinación de glicosilación de la enzima.. 4.8.5 Espectro UV-VIS del grupo hemo de fenol oxidasa de Scytalidium thermophilum.. 4.8.6 Análisis de metales.. 5. Diseño Experimental y Análisis Estadístico.. 6. Resultados.. 6.1 Cinética de crecimiento.. 6.2 Efecto de pH y temperatura sobre producción de fenol oxidasa.. 6.3 Purificación de la fenol oxidasa de S. thermophilum.. 6.4 Caracterización de la fenol oxidasa de S. thermophilum.. 6.4.1 Efecto de pH y temperatura sobre la actividad de fenol oxidasa.. 6.4.2 Actividad catalasa.. 6.4.3 Glicosilación de la enzima y espectro UV-VIS de la enzima.. 6.4.4 Contenido de metales.. 7 Discusión.. 8 Conclusiones.. 9 Referencias

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En este trabajo se estudió la producción de fenol oxidasa de tres cepas de Scytalidium thermophilum y se caracterizó la enzima con mayor capacidad catalítica. Primeramente se desarrolló una valoración de la producción de enzima en tres medios de cultivo: Almidón (MA), Papa Dextrosa y Levadura (PDL) e infusión de pasto (IP) a distintas condiciones de temperatura (42, 45 y 48°C) y pH (6, 7 y 8). Se observó la mayor actividad enzimática (115 mU/ml) con la cepa ECS-0602 en infusión de pasto pangola, a pH 8 y 45°C. Posteriormente se hizo la purificación de la enzima por cromatografía de intercambio iónico y fue caracterizada. La enzima posee un peso molecular de 87 kDa en gel SDS-PAGE al 10% y presenta mayor actividad a pH 7 y 55°C. Su velocidad máxima (Vmax) fue de 80.72 μmoles min-1.mg de proteína-1 y la constante de afinidad catalítica (Km) es de 302.79 mM, ambas determinadas con catecol como sustrato. La enzima purificada presentó actividad catalasa a distintos pH (5.5 a 8) a temperatura ambiente, con una mayor actividad catalasa de 10, 636.6 U/mg de proteína a pH 6. También se determinó que es una hemoproteína que contiene 0.7 moles de Fe por mol de proteína y está altamente glicosilada con 10.83 mg de azúcares por mg de proteína. spa

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