Producción y caracterización de las enzimas del hongo comestible Auricularia fuscosuccinea que intervienen en la degradación del contaminante endosulfán / Alfredo Francisco Yanez Montalvo

Tesis Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural El Colegio de la Frontera Sur 2014

Incluye bibliografía

1. Introducción.. 2. Objetivos.. 2.1. Objetivo General.. 2.2 Objetivos particulares.. 3. Hipótesis.. 4. Materiales y Métodos.. 4.1. Reactivos.. 4.2. Material biológico.. 4.3. Degradación de endosulfán en medio líquido.. 4.4. Actividad enzimática.. 4.5. Degradación de endosulfán con el extracto enzimático libre de células.. 4.6. Determinación de endosulfán.. 4.6.1. Análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CGEM.. 4.6.2 Validación del método.. 4.7. Producción y purificación enzimática de la cepa ECS-0210.. 4.8. Electroforesis en gel de poliacrilamida.. 4.9. Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática.. 4.10. Ensayos de degradación de endosulfán mediante las fracciones parcialmente purificadas de fenol oxidasa y lacasa.. 4.11. Análisis estadístico.. 5. Resultados.. 5.1. Selección de las cepas con mayor capacidad para la degradación del endosulfán en medio líquido.. 5.1.1 Actividad enzimática de los extractos del cultivo de A. fuscosuccinea.. 5.2. Ensayo para la degradación del endosulfán mediante el extracto enzimático de las cepas ECS-0201 y ECS-0210 en presencia y ausencia de mediadores.. 5.3 Validación de los análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM.. 5.4 Producción y purificación de enzimas fenol oxidasa y lacasa de Auricularia fuscosuccinea ECS- 0210.. 5.4.1. Producción enzimática.. 5.4.2. Purificación parcial: Precipitación con sulfato de amonio ((NH42SO4.. 5.4.3. Cromatografía de intercambio iónico.. 5.5. Determinación del peso molecular de las enzimas de A. fuscosuccinea ECS-0210.. 5.6. Estabilidad temperatura y pH de los extractos con actividad lacasa y fenol oxidasa de A. fuscosuccinea.. 5.7. Degradación de endosulfán por las fracciones de alta pureza enzimática.. 6. Discusión General.. 7. Conclusiones.. 8. Literatura Citada

9. Anexo.. Anexo1. Técnica para la extracción de Endosulfán residual (Williams, 1984.. Anexo 2. Manuscrito individual sometido para su publicación en la revista Mycoscience

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El endosulfán es un insecticida organoclorado, considerado como contaminante ambiental ubicuo. El hongo de pudrición blanca Auricularia fuscosuccinea degrada este insecticida durante su crecimiento en medio de cultivo líquido, pero se desconocen las enzimas que intervienen en el proceso. El objetivo del presente estudio fue identificar y evaluar la capacidad de degradación de las enzimas ligninolíticas de este hongo comestible. El trabajo se dividió en dos fases, en la primera se realizó una exploración con diferentes cepas de esta especie, para identificar aquella con la capacidad de degradar el endosulfán, la segunda fase consistió en purificar y evaluar las enzimas ligninolíticas más relevantes. La cepa A. fuscosuccinea ECS-0210 fue seleccionada para completar el estudio. Se identificaron dos enzimas ligninolíticas (fenol oxidasa y lacasa) en el extracto libre de células del hongo, que posiblemente degraden el endosulfán. En la segunda fase del trabajo se implementó un proceso de purificación que incluyera ambas enzimas. La fracción con actividad lacasa no fue purificada totalmente. Por su parte, la fracción fenol oxidasa fue purificada y correspondió a un peso molecular de 100 kDa. La actividad frente a diferentes rangos de temperatura y pH fue estudiado para cada extracto enzimático. Al evaluar la capacidad de los extractos de alta pureza para degradar el endosulfán, no se obtuvieron porcentajes de degradación superiores a 5%. Los resultados de este trabajo sugieren que las enzimas ligninolíticas de A. fuscosuccinea ECS-0210 no intervienen de manera directa en la degradación del insecticida endosulfán y posiblemente la transformación sea realizada por otra enzima o grupo enzimático presente en el extracto libre de células del hongo. spa

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